普拉替尼的作用机制_凯茵工业添加剂

背景及概述^[1]

随着酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）的研发应用，慢性髓细胞白血病（CML）和城染色体阳性急性淋巴细胞白血病（Ph+ALL）患者的临床结局较前明显改善。甲磺酸伊马替尼是全球首个批准上市的代TKIs，能特异性阻断腺苷三磷酸（ATP）在ABL激酶上的结合位置，使酪氨酸残基不能磷酸化，从而抑BCR-ABL蛋白活性，导致BCR-ABL阳性细胞增殖受抑、凋亡增加。这种针对发病机制的分子靶向治疗使CML和Ph+ALL患者的预后发生了巨大改变。然而，接近35%的CML患者接受伊马替尼治疗并未获得完全细胞遗传学缓解（CCyR），可能是这部分患者复发的主要原因。第二代TKIs（如达沙替尼和尼洛替尼）可改善伊马替尼治疗失败患者的疗效，延长总生存期。目前，达沙替尼、尼洛替尼都已被批准作为CML慢性期患者的一线治疗方案。尽管代、二代TKIs改善了CML及Ph+ALL患者的临床结局，但耐药仍发生在一些BCRABL突变患者中，尤其是T315I突变。在普纳替尼(普拉替尼)（ponatinib）获批之前，市场上没有TKIs能克服这些BCR-ABL突变患者耐药、难治或不耐受的情况。针对T315I突变，ARIAD制药公司研制了第三代TKIs———普纳替尼(普拉替尼)。普纳替尼(普拉替尼)与BCRABL激酶位点结合的独特作用机制，可抑制含T315I突变在内的BCR-ABL激酶活性，为CML及Ph+ALL患者带来了新的希望。普纳替尼(普拉替尼)曾用名AP24534，化学名为3-（2-咪唑[1，2-b]哒嗪-3-乙炔基）-4-甲基-N-[4-[（4-甲基-1-哌嗪基）-甲基]-3-（三氟甲基）]甲酰胺，相对分子质量：532.56，分子式为C29H27F3N6O。

作用机制^[1]

普纳替尼(普拉替尼)是一种口服多靶点TKIs合成物，为pan-BCR-ABL抑制剂。其体外抑制ABL与T315I突变ABL酪氨酸激酶活性的半抑制浓度（IC50）分别为0.4、2.0nmol·L-1，IC50值在0.1～20nmol·L-1，亦抑制其他致癌激酶的活性，包括血管内皮生长因子受体（VEGFR）、血小板衍生生长因子受体（PDGFR）、纤维母细胞生长因子受体（FGFR）、生促红素人肝细胞（Eph）受体、胞质酪氨酸激酶Src家族（SFK）、酪氨酸激酶膜受体基因（C-kit）、孤儿受体酪氨酸激酶（RET）、促血管生成素Ⅰ型酪氨酸激酶受体2（TIE2）和FMS样的酪氨酸激酶3（FLT3）。普纳替尼(普拉替尼)的分子结构是根据与T315I相互作用的不同方式设计，与现有激酶抑制剂结构无关。ABL抑制剂包括含天冬氨酸-丙氨酸-甘氨酸（DFG-in，1类抑制剂）和不含天冬氨酸-丙氨酸-甘氨酸（DFG-out，2类抑制剂）两种类型，这取决于它们与BCR-ABL相互作用的结合方式。1类抑制剂为代小分子激酶抑制剂，靶向作用于酶活化基团的ATP结合位点，以活化环的构型开放为特征；2类抑制剂与其他疏水位点结合，与1类抑制剂不同，形成构型失活。相比之下，2类抑制剂较1类有更高的选择性和疗效。

1类抑制剂包括舒尼替尼、达沙替尼，2类抑制剂包括伊马替尼、尼洛替尼和普纳替尼(普拉替尼)。不论结合方式，伊马替尼、达沙替尼和尼洛替尼都会与野生型ABL的门控基因残基Thr315侧链形成一个关键氢键，亦含部分亲脂性，与位于Thr315附近的疏水袋结合。但这种氢键易受破坏，且门控基因残基突变成异亮氨酸亦引起空间位阻，限制抑制剂结合临近的Thr315疏水袋。因此，伊马替尼、达沙替尼和尼洛替尼不能抑制Thr315点突变的ABL激酶活性。临床上观察到15%~20%的患者出现T315I突变，这种高度耐药变异发生在BCR-ABL融合蛋白ABL激酶ATP结合位点的门控基因区。值得注意的是，普纳替尼(普拉替尼)能避开与野生型BCRABLT315I的侧链结合，形成有利于结合T315I突变侧链异亮氨酸的范德华引力。此外，普纳替尼(普拉替尼)亦能调节异亮氨酸突变体的空间位阻，与T315I点突变结合抑制ABL激酶活性。

体外研究显示，普纳替尼(普拉替尼)对敏感与耐药CML细胞株均有明显的增殖抑制作用，且无论野生型BCR-ABL还是T315I突变都有效。此外，普纳替尼(普拉替尼)还具有抗伊马替尼耐药突变体（KIT及PDGFRα）及抗FGFR1-4、FLT3活性的作用[FGFR1-4、FLT3与骨髓增生异常综合征（MDS）、急性髓细胞白血病（AML）等其他恶性血液肿瘤的发生有关，能有效阻止T细胞激酶Lck的异位表达（Lck是一种原癌基因，在细胞中的异位表达可以诱发细胞癌变），但对内源性Fyn、Src影响不大。

临床研究^[1]

1. 抗CML

伊马替尼对BCR-ABL融合蛋白酪氨酸激酶活性的抑制作用，在许多CML患者治疗中起到了持久的应答效应，但出现酪氨酸激酶分子结构突变可导致耐药和疾病复发，即使换用或首选第二代TKIs治疗，T315I及其他复合突变引起的交叉耐药问题仍是当前CML治疗面临的一个主要挑战。针对难治性CML中的各BCR-ABL突变与耐药情况，以T315I突变为靶点的第三代TKIs产生了，主要的临床研究药物就有普纳替尼(普拉替尼)。体外活性实验显示，普纳替尼(普拉替尼)能抑制小鼠T315I突变起源的肿瘤生长，完全消除耐药的BCR-ABL突变细胞，具有抗野生型BCR-ABL及T315I突变体的活性。此外，还有报道CML患者中新发现的两种BCR-ABL突变体（L248R、T315V），对当前批准上市的代、二代TKIs均高度耐药，而对普纳替尼(普拉替尼)仅轻中度耐药。Ⅰ期临床试验纳入了60例CML耐药患者（43%处于慢性期，20%有T315I突变，91%已使用两种以上的TKIs药物），研究发现普纳替尼(普拉替尼)每日口服耐受的剂量范围为2～60mg，中位随访56周，常见的不良反应包括皮疹、骨髓抑制，剂量限制性毒性反应包括血脂肪酶或淀粉酶升高甚至胰腺炎。疗效分析显示，普纳替尼(普拉替尼)对CML患者有持久的治疗效果，慢性期患者中98%～100%达完全血液学缓解（CHR）、72%达主要细胞遗传学缓解（MCyR）、44%达主要分子生物学缓解（MMR），T315I突变患者中100%达CHR、92%MCyR，加速期与急变期患者中36%达CHR、32%达MCyR。由此推测，普纳替尼(普拉替尼)是一种强有效的口服TKIs，能封锁野生型与突变型BCR-ABL（包括T315I）融合蛋白的酪氨酸激酶活性，抑制BCR-ABL阳性细胞增殖从而发挥抗肿瘤作用。对于难治性的CML患者，尤其有T315I突变的患者来说，该药的临床应用将带来一种突破性进展。

2. 抗ALL

Ph染色体见于20%～30%的成人ALL患者，其预后比Ph-ALL更差。近年来，由于TKIs联合化疗方案的推广，Ph+ALL患者的预后有所改善，但耐药与疾病复发率高仍是当前临床治疗比较棘手的问题。THOMAS[21]报道Ph+ALL常发生T315I突变，即使换用第二代TKIs治疗，交叉耐药依旧不可避免。研究纳入了5例难治性Ph+ALL患者，均对当前一代和二代TKIs耐药，结果显示普纳替尼(普拉替尼)治疗有效且作用持久，患者100%达CHR、92%达MCyR。这预示普纳替尼(普拉替尼)很可能成为难治性Ph+ALL患者的佳治疗选择。

3. AML

在AML患者中，FLT3突变常见，且预后不良。近年来，FLT3-ITD突变成为小分子抑制剂靶向治疗中一个很有希望的靶点，FLT3抑制剂（AC220-奎扎替尼、索拉非尼等）的出现就是很好的例证。但对于二次FLT3点突变，上述FLT3-TKI中度耐药。普纳替尼(普拉替尼)作为新一代BCRABL抑制剂，不仅具有较强的抗BCR-ABL突变体（包括T315I）活性，也有抗FLT3作用。对转染FLT3-ITD、FLT3-TKD的鼠骨髓细胞研究显示，普纳替尼(普拉替尼)可以有效地诱导原代FLT3-ITD细胞系FLT3-TKD点突变细胞发生凋亡。体外活性实验中，用普纳替尼(普拉替尼)处理AC220-奎扎替尼、索拉非尼耐药的AML细胞，结果发现FLT3（F691L突变）轻度耐药，FLT3（D835突变）高度耐药。因此，普纳替尼(普拉替尼)作为有应用前景的新一代FLT3-TKI，进一步的临床试验研究有待开展。多柔比星作为AML常用的一种主要化疗药物，其主要不良反应有心脏毒性、乏力等，这和MAPK调控ZAK相关炎症因子的释放有关。此外，对白血病多重耐药相关ATP结合盒式（ATP-bindingcassette，ABC）蛋白的研究显示，普纳替尼(普拉替尼)通过增加ABCB1、ABCG2作用底物的吸收（但不影响ABCC1），从而有效抑制[（125）I]-IAAP与ABCB1、ABCG2蛋白连接，细胞耐药在一定程度上得以减轻，与柔红霉素、米托蒽醌等药物产生协同作用，可促进细胞凋亡。这两项研究启示我们，普纳替尼(普拉替尼)可减低多柔比星的不良反应，对其他蒽环类化疗药物也可能有类似作用，与化疗药物产生协同效应。所以，联合使用普纳替尼(普拉替尼)和化疗药物的效果和安全性有待进一步探索。

4. MDS

MDS8p11是一种罕见的侵袭性骨髓增生性疾病，以FGFR1融合蛋白阳性为特征，其产生源于一种特殊的染色体异位（8p11），具有持续活性，可导致细胞异常增殖。尽管FGFR1抑制剂在体外呈现了抗FGFR1融合蛋白活性的作用，但目前尚无药物应用于临床，这就促使评估其他药物是否存在此种潜在的治疗效应。实验中，以Ba/F3细胞系和原代细胞（FGFR1阳性）为研究对象，结果显示普纳替尼(普拉替尼)能减少Ba/F3细胞的增殖，可一定程度上消除残存的细胞，亦减少原代细胞中细胞群体的生长发育，尤其是FGFR1阳性细胞群体的数目明显减少。提示对于难治性MDS8p11患者，普纳替尼(普拉替尼)是一个非常有希望用于其治疗并改善预后的药物。

5. 抗干细胞白血病/淋巴瘤综合征（SCLL）

SCLL为髓、淋系细胞恶性增殖性疾病，起病多与FGFR1的异常表达有关，以具有持续的FGFR1激酶活性为特征，可迅速转变为AML和淋巴瘤，预后极差。目前分子靶向治疗尚未广泛用于SCLL的治疗，普纳替尼(普拉替尼)作为新一代的BCR-ABL抑制剂，也作用于FGFR家族。在REN等[27]对鼠BaF3细胞的研究中，发现该药能有效抑制FGFR1融合激酶及其下游效应器（如PLCY、Stat5、Scr等）的磷酸化作用，特异性地抑制镶嵌体FGFR1融合激酶CD34+祖细胞的细胞生长及集落生成，并显著延长SCLL细胞系成瘤小鼠的生存期，按30mg·kg-1剂量亦能明显延迟甚至抑制鼠KG1细胞的肿瘤再生。这些结果提示普纳替尼(普拉替尼)对FGFR1融合激酶的抑制作用很可能有益于SCLL患者的治疗，以及其他与FGFR1异常表达活化相关的人类疾病。

6. 抗其他FGFR起源的恶性肿瘤

普纳替尼(普拉替尼)是种多靶点激酶抑制剂，近几年多个研究发现其能强有力地抑制FGFR1-4家族融合激酶活性。鼠Ba/F3细胞诱导FGFR1-4激酶表达活化实验中，普纳替尼(普拉替尼)（IC50<40nmol·L-1）有效地抑制了FGFR介导的信号通路，在一组以子宫内膜癌、膀胱癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌为代表的14种细胞系研究中（包含了各种机制引起的FGFRs异常表达），普纳替尼(普拉替尼)（IC50为7～181nmol·L-1）亦能通过抑制FGFR介导的信号调节通路来抑制肿瘤细胞的生长。以子宫内膜癌患者为研究对象，发现普纳替尼(普拉替尼)与哺乳动物雷帕霉素（mTOR）抑制剂ridaforalimus联合使用能同时抑制FGFR2、mTOR，发挥双重通路调控作用，从而抑制肿瘤生长，这为高危子宫内膜癌患者提供了一种新的治疗策略。上述结果提示我们普纳替尼(普拉替尼)是一种有效的FGFR抑制剂，可考虑用于治疗FGFR起源的恶性肿瘤性疾病。

制备^[1]

1）3-溴代咪唑并［1，2-b］哒嗪(3)的制备

将200g(1.68mol)咪唑并［1，2-b］哒嗪(2)溶于2L氯仿中，加328.8g(1.85mol)N-溴代丁二酰亚胺，加热回流(61℃)过夜，TLC显示反应完全。有机相用水洗涤(1L×2)，饱和氯化钠溶液洗涤(1L×1)，无水钠干燥，旋干溶剂得321g浅黄色固体3，收率96.7%，mp145～147℃(文献：mp146～147℃)。MSm/z：197.9［M+H］+。

2）4-甲基-3-三甲基硅基乙炔基甲酸甲酯(5)的制备

在5L三颈瓶中依次加入3-碘-4-甲基甲酸甲酯(4)300g(1.09mol)、碘化亚2.06g (11mmol)、二(三基膦)二氯化钯7.63g(11mmol)、4L、三乙胺329.3g(3.25mol)、三甲基硅乙炔159.8g(1.63mol)，通入氩气置换体系中的气体，封闭反应体系，室温搅拌过夜，TLC检测反应完全。过滤反应液，滤液用水(1L×2)、饱和氯化钠溶液洗涤(1L×1)，无水钠干燥，旋干溶剂得267.4g红色固体5，收率99%，无需纯化直接用于下步反应。

3）3-乙炔基-4-甲基甲酸甲酯(6)的制备

在5L三颈瓶中，加入267.4g(1.09mol)化合物5，再加入4L甲醇，机械搅拌使其溶解，加入225g(1.63mol)碳酸钾，室温机械搅拌的同时TLC监控反应(每1min1次)进程，约5～10min反应完毕。将反应液倾入5L水中，搅拌均匀，过滤沉淀，用3L水洗涤一次，固体真空干燥，得到180g棕色固体6，收率95%，mp62～64℃。

4）3-(咪唑［1，2-b］哒嗪-3-乙炔基)-4-甲基甲酸甲酯(7)的制备

在5L三颈瓶中加入180g(1.03mol)化合物6、198g(1.01mol)化合物3、1.9g(10mmol)碘化亚铜、7g(10mmol)二(三基膦)二氯化钯、3LN-甲基吡咯烷酮(NMP)、193.4g(1.50mol)二异丙基乙基胺(DIEA)，通入氩气置换体系中的气体，70℃下机械搅拌过夜，TLC检测反应完全。将反应液倾入12L水中，搅拌均匀，过滤，所得固体干燥后加入1L，搅拌1h。过滤，用洗涤(200mL×2)滤饼，真空干燥得到灰褐色固体283g；用4L溶解该固体，加入38g活性炭，加热回流1h，趁热过滤，滤液静置析晶，得185g浅黄色晶体7，收率63.6%，mp141～143℃。

5）普纳替尼(普拉替尼)(1)的合成

在2L三颈瓶中，加入50g(0.18mol)4-((4-甲基哌嗪-1-基)亚甲基)-3-三氟甲基胺(8)、53.3g(0.18mol)化合物7、500mL四氢呋喃，机械搅拌，冷却至0℃，在机械搅拌条件下缓慢滴加到由123g(1.10mol)叔丁醇钾溶于500mL无水THF的溶液中，滴加完毕后维持低温10min，移至室温，搅拌过夜，TLC检测反应完全。将反应液倾入3L水中，搅拌均匀，(1L×3)萃取，合并有机相，用水(1L×3)洗涤，无水钠干燥，旋干溶剂，得黄色固体，加入100mL溶解该固体，搅拌2h。过滤，干燥，用1，4-二氧六环-水(体积比1∶1)重结晶，得到浅黄色固体普纳替尼(普拉替尼)(1)73g，收率71.9%，mp195～197℃。MSm/z：533.3［M+H］+。HPLC(面积归一化法)检测纯度为99.65%。

主要参考资料

[1] 第三代BCR-ABL酪氨酸激酶抑制剂普纳替尼(普拉替尼)

[2] 抗白血病新药普纳替尼(普拉替尼)的合成