N-[2-(叔丁基)基]-2-氧代甘氨酰-N-[(1S)-1-(羧基甲基)-2-氧代-3-(2，3，5，6-四氟氧基)丙基]-L-丙氨酰胺的作用_凯茵工业添加剂

背景及概述^[1][2]

Caspase家族是一大类凋亡的调控因子，是细胞凋亡的启动者和后的执行者。凋 亡启动因子由caspase-2、caspase-8、caspase-9和caspase-10组成，凋亡执行因子由 caspase-3、caspase-6和caspase-7组成。研究表明，在caspase家族中，caspase-3是 caspase级联“瀑布”下游关键的凋亡执行蛋白酶，它在正常细胞中是以酶原形式存在，受 凋亡刺激因素(缺血、细胞内钙超载等)作用后激活，活化的caspase-3可以激活核因子、细 胞骨架蛋白及DNA裂解酶等，引起细胞形态的变化如出现细胞皱缩、DNA裂解、染色质浓缩和 凋亡小体的形成等，终导致细胞凋亡，caspase-3在各种因素启动的凋亡程序中起后的 枢纽作用。脑缺血时，死亡受体介导的凋亡通路激活的caspase-8，进一步激活其下游效应 蛋白酶caspase-3及活线粒体凋亡通路导致细胞凋亡。研究表明，抑制caspase酶活性，够阻 止神经凋亡的发展，可减轻脑缺血损伤的程度，缩小梗死范围。

恩利卡生(Emricasan，1)是一种有效的、口服的半胱天冬酶抑制剂，化学名N-[2-(叔丁基)基]-2-氧代甘氨酰-N-[(1S)-1-(羧基甲基)-2-氧代-3-(2，3，5，6-四氟氧基)丙基]-L-丙氨酰胺。恩利卡生是一种首创一类新药，旨在降低介导炎症和细胞死亡或凋亡的酶的活性，通过降低这些酶的活性，恩利卡生可能阻断整个肝脏疾病的发展。Conatus 制药公司宣布恩利卡生（emricasan）用于治疗非酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪性肝炎的Ⅱ期临床试验获头条成功结果。该药是可口服的泛胱天蛋白酶（caspase）抑制剂，38 名非酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪性肝炎患者服用该药25 mg，2 次/d。28 d 后，与安慰剂组比，试验达到主终点时，给药组丙氨酸转氨酶给药组降低39%，安慰剂组降低14%。血清中3 种生物标志物，caspase 裂解细胞角蛋白18（caspase-cleavedcytokeratin 18，cCK18）、全长细胞角蛋白18，和caspase 3/7 也较基线时明显降低。cCK18 降低30%，说明此药可有效地减轻炎症。恩利卡生安全、耐受性良好，未见与药物有关的严重不良反应。

药理作用及应用^[3]

恩利卡生是一种有效的并且为口服的半胱天冬酶抑制剂，是美国Conatus制药公司发明的在研药物，用于治疗肝硬化或由于多种因肝脏受创所导致的严重肝损伤，目前已完成II期临床治疗试验，疗效优异。此外，在有典型心血管疾病风险的患者中，恩利卡生治疗组对血脂水平和胰岛素的敏感性没有副作用。随着恩利卡生进一步被用于对多种肝脏疾病治疗效果的试验研究，可望为肝脏疾病的进展阶段的治疗提供良好的医疗基础。

制备 ^[3-4]

方法1：以N-苄氧羰基-L-丙氨酸琥珀酰亚胺酯与L-天冬氨酸-β-叔丁酯经缩合得到二肽，经氯甲酸异丁酯活化，与重氮甲烷反应，溴化氢醋酸溶液溴取代，四氟酚取代溴，再经过硼氢化钠还原，氢气环境下Pd-C去苄氧羰基保护得到中间体7；邻叔丁基胺与氯草酸甲酯酰胺化，再水解甲酯得到中间体10，再与7 缩合生成酰胺，再经过氧化，去叔丁酯保护得到目标化合物恩利卡生1。

具体步骤如下：

步骤1：(a)氯甲酸异丁酯(1.1eq)，三乙胺TEA(1.1eq)，0 ℃加完，室

温1 h；(b)1N 氢氧化锂溶液(1.2eq)，1，4-二氧六环溶剂，室温1 h；(c)双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺BSTFA(2.0eq)，L-天冬氨酸-β-叔丁酯(1.0eq)，乙腈，室温24h；(d)i.氯甲酸异丁酯(1.5eq)，N-甲基吗啡啉(1.6eq)，THF，-10 ℃，20 min；ii.重氮甲烷溶液(2.5eq)，0 ℃，15 min；iii.48 %溴化氢醋酸溶液，THF，0 ℃-室温，30min；(e)2，3，5，6- 四氟酚(1.2eq)，KF(4.0eq)，THF，室温16 h；(f)NaBH4(1.1eq)，THF，0 ℃，1 h；(g)10 % Pd-C/H2，甲醇，室温2 h；(h)10(1.0eq)，HoBt(1.05eq)，EDCI(1.4eq)，N-甲基吗啡啉(1.05eq)，二氯甲烷，室温16 h；(i)二碘(3.8eq)，2，2，6，6-四甲基哌啶-氮氧化物TEMPO(0.2eq)，二氯甲烷，室温16 h；(j)三

氟，二氯甲烷，甲醚，室温1 h。

步骤2：4-(3-哌啶基)胺盐的制备与纯化：将上一步的游离胺产品溶于300mL 无水乙醇中，5 分钟内加入1 mol/L 的(L)-乙醇溶液(28mL，0.028mol)，加毕，反应液回流2 小时，然后缓慢降温，冷冻析晶，待结晶完全后过滤，滤饼用无水乙醇(100mL×2)洗涤，干燥，得浅黄色固体5.9g，收率60%。

方法2：以丙酮酸为原料，经酰氯化反应，与L-丙氨酸甲酯缩合，再水解甲酯，继续酰氯化反应，与(S)-3-氨基-5-(2，3，5，6-四氟氧基)-4-氧代戊酸叔丁酯缩合，丙酮酸酮经过氧化，得到羧酸衍生物，继续酰氯化反应，与邻叔丁基胺缩合成酰胺，用三氟去叔丁基保护得到目标产物1。

方法3：一种恩利卡生的合成方法，包括以下步骤：

A)制备中间体(I)：先由丙酮酸在酰氯化反应用的溶剂中与酰氯化试剂进行酰氯化反应，得到丙酮酰氯，再将丙酮酰氯和L-丙氨酸甲酯在缩合反应用的溶剂和缚酸剂碱的体系中进行缩合反应，得到中间体(I)；

B)制备中间体(II)：先将由步骤A)得到的中间体(I)投入到由碱、水解反应用的溶剂和水构成的体系中进行水解反应，得到羧酸衍生物，将该羧酸衍生物在酰氯化反应用的溶剂中与酰氯化试剂进行酰氯化反应，得到酰氯衍生物，再将该酰氯衍生物与(S)-3-氨基- 5-(2，3，5，6-四氟氧基)-4-氧代戊酸叔丁酯在缩合反应用的溶剂和缚酸剂碱的体系中进行缩合反应，得到中间体(II)，其中，所述的水解反应用的溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇或叔丁醇；

C)制备成品：先将由步骤B)得到的中间体(II)投入到由氧化试剂、氧化反应用的溶剂和水构成的体系中进行氧化反应，得到羧酸衍生物，将该羧酸衍生物在酰氯化反应用的溶剂中与酰氯化试剂进行酰氯化反应，得到酰氯衍生物，再将该酰氯衍生物与2-叔丁基胺在由缩合反应用的溶剂和缚酸剂碱的体系中进行缩合反应，得到叔丁酯衍生物，再将该叔丁酯衍生物用三氟处理，进行水解反应，得到成品恩利卡生。

主要参考资料

[1] 恩利卡生治疗非酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪性肝炎

[2] CN201710021142.X 恩利卡生在制备治疗缺血/再灌注损伤药物中的应用

[3] CN201510393792.8 一种恩利卡生的合成方法

[4] 一种Caspase 抑制剂恩利卡生的合成